AccuPid HCV Quantification Kit
I. Thông tin xét nghiệm
AccuPid HCV Quantification Kit được sử dụng trong xét nghiệm định lượng RNA HCV trong huyết thanh người. Xét nghiệm này được sử dụng trước và trong suốt quá trình điều trị nhằm đánh giá mức độ đáp ứng thuốc ở bệnh nhân. Kết quả của xét nghiệm này phải được phân tích cùng với tất cả các kết quả xét nghiệm miễn dịch hay lâm sàng khác.
Không sử dụng xét nghiệm này để sàng lọc hay xác nhận việc nhiễm HCV.
II. Thông tin bệnh
Virus viêm gan C (Hepatitis C Virus – HCV) là một trong những tác nhân chính gây viêm gan siêu vi ở người. Nhiễm virus viêm gan C thường không có triệu chứng nhưng khoảng 85% số người nhiễm chuyển sang tình trạng mạn tính với nhiều hậu quả như xơ gan, mất chức năng gan hoặc ung thư tế bào gan. Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm mạn tính HCV nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”. Các kỹ thuật phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép định bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện trong máu, rất cần thiết cho bệnh nhân bị tiêu giảm miễn dịch (immunosuppressed). Mặt khác, một số kỹ thuật phân tử như real-time PCR còn cho phép xác định chính xác hàm lượng virus trong máu, hay xác định týp HCV nhiễm, phục vụ hữu hiệu cho việc tiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị.
III. Nguyên lý hoạt động của kit
AccuPid HCV Quantification Kit hoạt động dựa trên ba bước chính: (1) Xử lý mẫu huyết thanh để thu được RNA của HCV; (2) Chuyển RNA thành cDNA; (3) Nhân bản cDNA HCV bằng cặp mồi đặc hiệu và định lượng sản phẩm nhân bản dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được.
Hỗn hợp phản ứng PCR chứa một cặp mồi được thiết kế trong vùng gene 5’-UTR (vùng 5’ không mã hóa) của bộ gene HCV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 103 cặp base. Sản phẩm nhân bản được phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có được do sự phân cắt mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho HCV.
Hỗn hợp phản ứng PCR còn chứa một cặp mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho gene biểu hiện RNA mã hóa cho protein ribosome tiểu phần lớn của người (RPLP0). Gene RPLP0 được phiên mã với cường độ tương đối ổn định, đóng vai trò chứng nội nội sinh để kiểm soát hiệu quả của quá trình tách chiết RNA, quá trình phiên mã ngược và phản ứng PCR.
Số lượng RNA HCV ban đầu có trong ống phản ứng được xác định dựa vào một đường chuẩn. Đường chuẩn này được xây dựng bằng những hàm lượng khác nhau của các đoạn DNA ngắn mô phỏng vùng gene HCV được nhân bản.
Chuẩn bị mẫu
RNA bộ gene của các phần tử virus HCV có trong huyết thanh được thu nhận bằng các kit tách chiết:
1. AccuRive pRNA Extraction Kit (KT-BioTech)
2. QIAamp Minelute Virus Spin Kit (Qiagen)
3. QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)
Phản ứng phiên mã ngược (Reverse transcription – RT)
Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR không sử dụng RNA làm mạch khuôn cho quá trình nhân bản. Vì vậy, để phản ứng PCR xảy ra, RNA của HCV cần phải được chuyển thành cDNA thông qua phản ứng phiên mã ngược. Trong phản ứng này, các đoạn DNA ngắn dài 6 nucleotide bắt cặp ngẫu nhiên trên RNA bộ gene của HCV và mRNA của người. Enzyme reverse transcriptase sử dụng các đoạn DNA này như mồi cho quá trình tạo các mạch DNA bổ sung (complement DNA – cDNA) với RNA. Các mạch cDNA sau đó được dùng làm mạch khuôn cho Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR.
Phản ứng PCR
Vùng gene nhân bản
Vùng gene nhân bản được chọn phải có tính bảo tồn cao để đảm bảo sự nhân bản diễn ra đồng đều giữa các genotype khác nhau của HCV. Ngoài ra, vùng gene mục tiêu này cũng phải có độ tương đồng thấp khi so sánh với các vùng gene của người hay các tác nhân khác có thể xuất hiện trong mẫu. AccuPid HCV Quantification sử dụng cặp mồi và mẫu dò Taqman bắt cặp trên một vùng dài 103 bp của vùng 5’-UTR trong bộ gene HCV.
Thành phần phản ứng PCR
cDNA có được từ phản ứng phiên mã ngược sẽ được bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR. Tại đây, phản ứng PCR sẽ diễn ra. Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử cDNA tách ra khỏi RNA và tồn tại dưới dạng mạch đơn. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase lúc này cũng được hoạt hóa. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi và mẫu dò đến bắt cặp với vùng gene mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. Hiện tượng nhân bản chỉ xảy ra ở vùng gene mục tiêu chứ không xảy ra trên toàn bộ bộ gene HCV.
Nguyên lý phát hiện sản phẩm PCR
Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò Taqman), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Mẫu dò Taqman bao gồm một đoạn DNA mạch đơn dài khoảng 30-40 nucleotide đặc hiệu cho vùng gene mục tiêu cùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử thu hút huỳnh quang (quencher) được gắn cộng hóa trị ở 2 đầu. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gene mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra.
Nguyên tắc xác định lượng trình tự mục tiêu
Việc định lượng trình tự mục tiêu cho vào phản ứng được thực hiện tại giai đoạn pha mũ của quá trình nhân bản. Số lượng trình tự mục tiêu ban đầu càng cao thì tín hiệu huỳnh quang thu được càng sớm vượt cao hơn tín hiệu huỳnh quang nền. Chu kỳ phản ứng mà tại đó tín hiệu huỳnh quang thu được do sự nhân bản trình tự mục tiêu vượt khỏi tín hiện nền được gọi là “chu kỳ ngưỡng” (threshold cycle – Ct). Như đã nói trên, do gene chứng nội RPLP0 được phiên mã ở mức độ ổn định giữa các bệnh nhân nên giá trị Ct của màu huỳnh quang tương ứng với cDNA chứng nội này thu được từ các mẫu cũng sẽ bằng nhau.
Số lượng cDNA HCV ban đầu có trong ống phản ứng được xác định dựa vào một đường chuẩn. Đường chuẩn này được xây dựng từ giá trị Ct của 3-4 ống phản ứng chứa những hàm lượng khác nhau (5x103, 5x105, 5x107) của các đoạn DNA ngắn mô phỏng vùng gene HCV được nhân bản. Giá trị sử dụng cho trục tung của đường chuẩn là giá trị Ct, giá trị sử dụng cho trục hoành của đường chuẩn là số lượng copies trình tự mục tiêu ban đầu. Lượng trình tự mục tiêu ban đầu có trong ống phản ứng tương ứng với mẫu xét nghiệm được xác định dựa vào đường chuẩn và giá trị Ct thu được của mỗi mẫu xét nghiệm.