Thông số kỹ thuật

Thể tích hóa chất đóng thừa lên tới 60 test/hộp

Bộ kit định lượng HBV trong huyết tương và huyết thanh người trong chẩn đoán và điều trị HBV

Hệ Primer Probe nhân bản vùng đặt hiệu của HBV và chứng nội tại

Chứng nội tại tách chiết cùng mẫu kiểm tra quy trình tách và chất ức chế

Độ nhạy: 50-100 copies/ml (tùy thuộc vào kit tách và quy trình tách chiết DNA)

Setup phản ứng nhiệt độ phòng

Cung cấp gồm 

Master Mix 3x 200 µl chứa Tris-HCL pH8, KCl, MgCl2

Primobe Mix: 3x 210 µl chứa các mồi và probe đặc hiệu cho HBV (FAM, HEX)

Chứng dương: DNA HBV 4 nồng độ 

Eppendorf 0,2 ml: 57 chiếc

Tương thích với hầu hết các máy Realtime PCR: Rotor Gene Q (Qiagen), 7500, 7500 Fast (Thermo Fisher), AriaMX, Mx 3005p...

1. Thông tin tác nhân gây bệnh

Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus – HBV) là một trong những tác nhân chính gây viêm gan siêu vi ở người. Trên 2 tỉ người trên thế giới nhiễm HBV, trong đó hơn 350 triệu người nhiễm mạn tính. Viêm gan mạn tính do HBV có thể dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Các chẩn đoán lâm sàng, sinh hóa thường không đặc hiệu trong khi các xét nghiệm miễn dịch thì không hiệu quả trong nhiều trường hợp - ở giai đoạn cửa sổ, ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và trên các týp huyết thanh đột biến của virus. Mặt khác, các chẩn đoán trên không cho kết quả định lượng trong khi việc xác định hàm lượng virus ở bệnh nhân là cần thiết để theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị. Kỹ thuật real- time PCR áp dụng vào chẩn đoán cho phép định lượng chính xác DNA HBV trong máu bệnh nhân.

AccuPid HBV Quantification Kit dựa trên nguyên tắc multiplex real-time PCR, nhân bản vùng gene đặc trưng của HBV. Kit mang nhiều ưu điểm: dễ thực hiện, độ đặc hiệu, độ nhạy cao, có chứng nội ngoại sinh và các đối chứng khác kiểm soát khả năng dương tính giả hay âm tính giả từng mẫu.

2. Nguyên lý hoạt động

AccuPid HBV Quantification Kit hoạt động dựa trên hai bước chính: (1) Xử lý mẫu huyết thanh để thu được DNA của HBV; (2) Nhân bản DNA HBV bằng cặp mồi đặc hiệu và định lượng sản phẩm nhân bản dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được.

Hỗn hợp phản ứng PCR của AccuPid HBV Quantification Kit chứa bộ mồi và mẫu dò TaqMan được thiết kế với bộ gene HBV để nhân bản và phát hiện sản phẩm nhân bản DNA HBV bằng tín hiệu huỳnh quang. Số lượng DNA HBV ban đầu có trong ống phản ứng được xác định dựa vào một đường chuẩn. Đường chuẩn này được xây dựng bằng những hàm lượng khác nhau của các đoạn DNA ngắn mô phỏng vùng gene HBV được nhân bản.

Ngoài ra, hỗn hợp còn chứa một cặp mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho một đoạn DNA nhân tạo có trình tự khác trình tự gene HBV gọi là chứng nội ngoại sinh (internal control, IC) - đ được ly trích cùng với DNA trong mẫu nhằm phát hiện các chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả của quá trình tách chiết DNA cũng như phản ứng PCR.

Quy trình có thể hoàn tất trong 4 giờ.

2.1 Chuẩn bị mẫu

Mẫu máu toàn phần được ly tâm phân đoạn để thu lấy huyết thanh. DNA bộ gene của các phần tử virus HBV có trong huyết thanh được thu nhận bằng các phương pháp khác nhau:

+) AccuRive pDNA Extraction Kit (Khoa Thương)

+) AccuRive sDNA Extraction Kit (Khoa Thương)

+) Magattract Cador Pathogen Kit (Qiagen)

+) QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen)

+) QIAamp DSP Virus Spin Kit (Qigen)

+) QIAamp DSP Virus Kit (Qiagen)

+) TANBead HBV Auto Plate (Tanbead)

Phản ứng PCR

Vùng gene nhân bản

Vùng gene nhân bản được chọn phải có tính bảo tồn cao để đảm bảo sự nhân bản diễn ra đồng đều giữa các genotype khác nhau của HBV. Vùng gene mục tiêu này cũng phải có độ tương đồng thấp khi so sánh với các vùng gene của người hay các tác nhân khác có thể xuất hiện trong mẫu. AccuPid HBV Quantification Kit sử dụng một cặp mồi và mẫu dò Taqman bắt cặp trên một vùng dài 118 bp của gene S trong bộ gene HBV.

2.2. Thành phần phản ứng PCR

DNA sau khi được tách chiết sẽ được bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR. Tại đây, phản ứng PCR sẽ diễn ra. Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase lúc này cũng được hoạt hóa. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi và mẫu dò đến bắt cặp với vùng gene mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Trong quá trình nhân bản diễn ra, theo từng chu kì phản ứng, tín hiệu huỳnh quang do máy thu được tỉ lệ thuận với số lượng copies phân đoạn DNA hình thành sau mỗi chu kì phản ứng. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đ định trước. Hiện tượng nhân bản chỉ xảy ra ở vùng gene mục tiêu chứ không xảy ra trên toàn bộ bộ gene HBV.

2.3. Nguyên lý phát hiện sản phẩm PCR

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò Taqman), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Mẫu dò Taqman bao gồm một đoạn DNA mạch đơn dài khoảng 30-40 nucleotide đặc hiệu cho vùng gene mục tiêu cùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử thu hút huỳnh quang (quencher) được gắn cộng hóa trị ở 2 đầu. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gene mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra.

2.3. Nguyên tắc xác định lượng trình tự mục tiêu

Việc định lượng trình tự mục tiêu cho vào phản ứng được thực hiện tại giai đoạn pha mũ của quá trình nhân bản. Số lượng trình tự mục tiêu ban đầu càng cao thì tín hiệu huỳnh quang thu được càng sớm vượt cao hơn tín hiệu huỳnh quang nền. Chu kỳ phản ứng mà tại đó tín hiệu huỳnh quang thu được do sự nhân bản trình tự mục tiêu vượt khỏi tín hiện nền được gọi là “chu kỳ ngưỡng” (threshold cycle – Ct). Do lượng DNA chứng nội ngoại sinh bổ sung vào tất cả các mẫu trước giai đoạn tách chiết là như nhau nên giá trị Ct của màu huỳnh quang tương ứng với DNA chứng nội thu được từ các mẫu này cũng sẽ bằng nhau.

Số lượng DNA HBV ban đầu có trong ống phản ứng được xác định dựa vào một đường chuẩn. Đường chuẩn này được xây dựng từ giá trị Ct của 3 mix phản ứng có nồng độ khác nhau (104, 106, 108) của các đoạn DNA ngắn mô phỏng vùng gene HBV được nhân bản. Giá trị sử dụng cho trục tung của đường chuẩn là giá trị Ct, giá trị sử dụng cho trục hoành của đường chuẩn là số lượng copies trình tự mục tiêu ban đầu. Lượng trình tự mục tiêu ban đầu có trong ống phản ứng ứng với mẫu xét nghiệm được xác định dựa vào đường chuẩn và giá trị Ct thu được của mỗi mẫu xét nghiệm.