Quy trình phát hiện SARS-COV-2 bằng phương pháp realtime RT-PCR (WHO-BERLIN)
Trong thời gian khi dịch Covid-19 bùng phát đầu năm 2020, để nhanh chóng hỗ trợ các đơn vị mới tiếp cận, chưa có nhiều kinh nghiệm trong triển khai kỹ thuật Real-time PCR, nhóm kỹ thuật ứng dụng của công ty Suran đã nhanh chóng lược dịch và tổng hợp tài liệu được công bố để viết lại quy trình xét nghiệm Sars-Cov-2 một cách đơn giản và ngắn gọn nhất giúp cho những người mới tiếp cận đến kỹ thuật này có thể dễ dàng nắm bắt và làm chủ kỹ thuật.
Tài liệu này chỉ mang tính chất tham khảo, trong quá trình viết quy trình không thể tránh khỏi sai sót mong nhận được sự góp ý của quý khách hàng
Quy trình phát hiện SARS-COV-2 bằng phương pháp realtime RT-PCR (WHO-BERLIN)
1. Quy trình tách chiết RNA-QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen):
a. Pha hóa chất và buffer:
- Hoàn nguyên carrier RNA: Cho Buffer AVE vào ống carrier RNA đông khô để đạt nồng độ 1 µg/µl (Ví dụ ống carrier RNA 310 µg cho thêm 310 µl Buffer AVE) . Chia nhỏ carrier ra các ống microtube 1.5ml để dùng lâu dài bảo quản ở -30oC đến -15oC. Tính toán lượng chia phù hợp để không rã đông quá 3 lần.
- Pha buffer AVL/Carrier RNA/IC
Buffer AVL-carrier RNA bền ở 2-8 oC lên tới 48h. Nếu hỗn hợp dung dịch có kết tủa khi bảo quản ở 2-8oC nên cần ủ ấm ở nhiệt độ 80 oC trước khi sử dụng. Không nên ủ ấm quá 6 lần. Không nên ủ ở 80 oC quá 5 phút.
- Pha buffer AW1, AW2: Thêm Ethanol (96-100%) trong lần đầu sử dụng theo đúng thể tích ghi trên chai.
b. Các bước thực hiện:
Bước 1: Hút 560 µl buffer AVL-carrier RNA vào ống microtube 1.5 ml.
Bước 2: Thêm 140 µl mẫu vào ống Microtube bên trên. Vortex mạnh trong 15 giây.
Bước 3: Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó, ly tâm nhẹ để loại bỏ giọt nước động trên nắp.
Bước 4: Thêm 560 µl cồn (96-100%) vào mẫu và vortex mạnh trong 15 giây. Sau đó, ly tâm nhẹ để loại bỏ giọt nước đọng trên nắp.
Bước 5: Chuyển toàn bộ hỗn hợp ở bước 4 lên cột (Chia 2 lần, mỗi lần 630 µl). Đóng nắp, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Thay ống hứng mới, loại bỏ dịch.
Bước 6: Thêm 500 µl buffer AW1. Ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ dịch, thay ống hứng mới.
Bước 7: Thêm 500 µl buffer AW2. Ly tâm tốc độ tối đa 14000 vòng trong 3 phút. Loại bỏ dịch.
Bước 8: Đặt cột sang 1 ống tube 1.5ml khác . Ly tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng trong 1 phút để làm khô màng.
Bước 9: Đặt cột sang ống microtube 1.5ml , cho 60 µl buffer AVE vào giữa màng. Đóng nắp ủ tại nhiệt độ phòng 1 phút. Sau đó ly tâm ở tốc độ 8000 vòng trong 1 phút.
RNA virus được lưu trong ống bảo quản ở -30oC đến -15oC.
1. Quy trình realtime PCR phát hiện SARS-COV-2:
Tổng quan
Xét nghiệm chẩn đoán RT-PCR được thiết kế trước khi có trình tự 2019-nCoV (Sars-Cov-2) đầu tiên. Sau có trình tự chủng 2019-nCoV (Sars-Cov-2), các thử nghiệm sau đây đã được chọn dựa trên sự phù hợp của chúng với 2019-nCoV (Sars-Cov-2) theo sự kiểm tra của việc căn chỉnh trình tự và đánh giá ban đầu (Hình 1 và 2). Tất cả các xét nghiệm có thể sử dụng RNA của SARS-CoV làm chứng dương. Chứng RNA được tổng hợp cho xét nghiệm 2019-nCoV ở vùng gen E có sẵn thông qua EVAg. Chứng RNA tổng hợp cho chủng 2019- nCoV vùng gene RdRp dự kiến sẽ có sẵn thông qua EVAg từ ngày 21 tháng 1 trở đi.
Xét nghiệm sàng lọc đầu tiên: Xét nghiệm gen E
Xét nghiệm khẳng định: Xét nghiệm gen RdRp
Vật liệu và thiết kế thí nghiệm
Mẫu lâm sàng và dịch nổi nuôi cấy tế bào CoV
Các mẫu hô hấp được lấy trong năm 2019 từ các bệnh nhân nhập viện tại trung tâm y tế Charité và được thử nghiệm bởi NxTAG® Respiratory Pathogen Panel (Luminex) hoặc trong các trường hợp MERS-CoV bằng xét nghiệm MERS-CoV upE như đã được công bố trước đó.
Dịch nổi nuôi cấy tế bào từ coronavirus có sẵn tại nghiên cứu của chúng tôi và phòng thí nghiệm lâm sàng. RNA đặc trưng virus cúm gia cầm (H5N1) được lấy từ bảng xét nghiệm của Hiệp hội Xúc tiến Đảm bảo Chất lượng Đức trong Phòng thí nghiệm Y tế (INSTAND).
Thiết kế thí nghiệm
Đối với thiết kế oligo và đánh giá in-silico, chúng tôi đã tải xuống tất cả trình tự virus liên quan đến SARS có sẵn tại GenBank trước ngày 1 tháng 1, 2020 và một phần (nếu > 400 nucleotide). Danh sách (n = 729 trình tự đầu vào) đã được kiểm tra thủ công và trình tự nhân tạo (có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm, tổng hợp, v.v.), cũng như các bản sao trình tự đã bị xóa, dẫn đến danh sách cuối cùng là 375 trình tự. Các trình tự này được sắp xếp thẳng hàng và sự sắp gióng được sử dụng cho thiết kế xét nghiệm. Sự sắp gióng đó sau đó được bổ sung bởi các trình tự từ Vũ Hán. Tất cả trình tự phát hành hiện tại phù hợp với các đoạn gene (Hình 2). Tổng quan về vùng gắn oligo trên các vùng đặc hiệu của virus liên quan đến SARS đến dơi được hiển thị trong đính kèm.
Phản ứng realtime PCR phiên mã ngược
Tất cả các xét nghiệm được sử dụng cùng các điều kiện giống nhau. Trình tự mồi và đầu dò, cũng như tối ưu hóa nồng độ được thể hiện trong Bảng 1. Một phản ứng 25 ul đã được thiết lập có chứa 5 μl RNA, 12,5 μl dung dịch đệm phản ứng 2 X được cung cấp bởi kit Superscript III one step RT-PCR system with Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, chứa 0,4 mM mỗi deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và 3,2 mM magiê sunfat), 1 μl enzyme phiên mã ngược / mix Taq từ bộ kit, 0,4 μl dung dịch magiê sunfat 50 mM (Invitrogen - không được cung cấp với bộ kit) và 1 μl albumin huyết thanh bò chưa được acetyl hóa. Tất cả các oligonucleotide được tổng hợp và cung cấp bởi Tib-Molbiol, Berlin. Qúa trình luân nhiệt được thực hiện tại 55 ° C trong 10 phút để phiên mã ngược, tiếp theo là 95 ° C trong 3 phút và sau đó 45 chu kỳ 95 ° C trong 15 giây, 58 ° C trong 30 giây.
a. Xét nghiệm sàng lọc Sars-Cov-2 bằng gene E:
-Thể tích mastermix (20 μl) + mẫu RNA (5 μl)
Thành phần mastermix | Thể tích |
Nước (RNAse free) | 3.6 μl |
2x Reaction mix | 12.5 μl |
MgSO4(50mM) | 0.4 μl |
Primer E_Sarbeco_F1 (10 µM | 1 μl |
Primer E_Sarbeco_R2 (10 µM) | 1 μl |
Probe E_Sarbeco_P1 (10 µM) | 0.5 μl |
SSIII/Taq EnzymeMix | 1 μl |
Tổng thể tích mastermix | 20 μl |
-Chu trình nhiệt:
55°C | 10 phút | 1 chu kỳ |
94°C | 3 phút | 1 chu kỳ |
94°C | 15 giây | 45 chu kỳ |
58°C | 30 giây |
Các mẫu dương tính với gene E thì chạy tiếp đến gene RdRp
b. Xét nghiệm khẳng định Sars-Cov-2 bằng gene RdRp:
-Thể tích mastermix (20 μl) + mẫu RNA (5 μl)
Thành phần mastermix | Thể tích |
Nước (RNAse free) | 2.1 μl |
2x Reaction mix | 12.5 μl |
MgSO4(50mM) | 0.4 μl |
Primer RdRP_SARSr-F2 (10 µM | 1.5 μl |
Primer RdRP_SARSr-R1 (10 µM) | 2 μl |
Probe RdRP_SARSr-P2(10 µM) | 0.5 μl |
SSIII/Taq EnzymeMix | 1 μl |
Tổng thể tích mastermix | 20 μl |
-Chu trình nhiệt:
55°C | 10 phút | 1 chu kỳ |
94°C | 3 phút | 1 chu kỳ |
94°C | 15 giây | 45 chu kỳ |
58°C | 30 giây | |