Một Số Lưu Ý Trong Tách Chiết Viral DNA (DNA Virus)
Các bạn sắp tới sẽ hoặc đang làm việc với virus DNA như HBV, CMV. HPV, BKV, EBV...? Các bạn đang sử dụng kit tách chiết của 1 hãng nào đó (Qiagen, Roche, Thermo...)? Các bạn đang gặp vấn đề tách chiết mẫu khó thậm chí đã sử dụng kit của Qiagen? Dưới đây là một số kinh nghiệm chia sẻ để tiến hành công việc thuận lợi.
Để tách chiết Viral DNA các hãng có các kit tách chuyên biệt cho virus. Qiagen có kit cho tách viral DNA, RNA đồng thời QIAamp Minelute Virus Kit.
Theo kinh nghiệm thực tế thì việc tách bằng kit chuyên biệt của Qiagen tuy hiệu quả nhưng chi phí sẽ tăng cao, nếu sử dụng kit tách virus chuyên biệt của một số hãng chưa có thương hiệu, it được tham khảo tuy rẻ nhưng chất lượng thì cần kiểm chứng qua thời gian.
Trong khi đó kit tách QIAamp DNA Blood Mini Kit và QIAamp DNA Mini Kit tách chiết viral DNA rất hiệu quả. Tuy nhiên sử dụng kit này cần có một số lưu ý rất quan trọng mà người sử dụng không để ý hoặc thường bỏ qua dẫn đến giảm độ nhạy của quy trình. Dưới đây là quy trình tách viral DNA hiệu quả.
1. Quy trình tách Viral DNA thường sử dụng
Thông thường mọi người thường sử dụng nguyên quy trình Blood or Body Fluid trong hướng dẫn sử dụng [2] để tách viral tự do hoặc viral nội bào. Quy trình gồm các bước như sau:
B1. Bổ sung 20 uL Protease (hoặc proteinase K) vào mỗi ống epp 1.5 mL
B2. Bổ sung 200 uL mẫu (máu tổng số, huyết thanh, dịch chiết, buffy coat…) vào ống ở bước (1) và vortex
B3. Bổ sung 200 uL Buffer AL. Vortex 15s (Lưu ý không cho Protease/Proteinase K trực tiếp vào AL)
B4. Ủ 56oC/10 phút, lắc đều dung dịch trong quá trình ủ. Spin down cho dung dịch lắng hết xuống đáy, không dính trên nắp
B5. Bổ sung 200 uL EtOH 100% vào mẫu. Invert 15s. Spin down
B6. Lên cột. Ly tâm 8000 rpm/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, chuyển cột sang 1 ống thu mới (được cấp bởi kit)
B7. Cho 500 uL Buffer AW1. Ly tâm 8000 rpm/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit)
B8. Cho 500 uL Buffer AW2. Ly tâm 14000 rpm/ phút trong 3 phút
B9. Chuyển cột ly tâm sang ống thu mới. Ly tâm khan tốc độ tối đa (14,000 rpm) trong 1 phút
B10. Chuyển cột sang ống 1.5ml sạch. thêm 50 - 200 uL Buffer AE. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 8000 rpm/phút trong 2 phút.
Các bước (3), (5), (10) là các bước cần chú ý và được hãng khuyến cáo với một số thay đổi (thể hiện trong handbook).
2. Quy trình tách viral DNA khuyến cáo
- Sử dụng quy trình Blood or Body Fluid ở trên với một số thay đổi sau:
- Luôn sử dụng carrier RNA (5-10 ug/200 ul AL) trong Bước 1 quy trình để tăng tối đa hiệu quả gắn DNA của virus lên cột. Việc sử dụng Carrier RNA rất quan trọng đặc biệt với các mẫu nồng độ virus nhỏ hơn 10000 copies/ml. Khi bổ sung Carrier RNA cần tuân thủ đúng hướng dẫn của hãng để đạt hiệu quả.
- Bước 5, tăng thể tích EtOH từ 200 lên 230 uL để việc gắn DNA lên cột được tối ưu.
- Nếu sử dụng Internal Control DNA (IC) để kiểm tra quá trình tách chiết DNA và sự hiện diện của chất ức chế thì cần lưu ý chiều dài của IC phải lớn hơn hoặc bằng 200bp. Vì kit tách QIAamp DNA Blood Mini Kit và DNA Mini Kit chỉ có thể tách được sản phẩm từ 200bp - 40kb. Đặc biệt IC không được cho trực tiếp vào mẫu mà phải bổ sung sau khi add AL.
- Nếu cần thiết có thể cô đặc mẫu bằng màng lọc Amicon® Centricon-100 (Millipore, 2 ml), Microsep 100 (Filtron, 3.5 ml), and UltraFree® CL (Millipore, 2 ml) hoặc các hãng khác tương đương.
- Tại bước Elution có thể elute 60 ul, tuy nhiên để đạt hiệu quả tốt đa thì nên elute 2 lần mỗi lần 50 ul với đệm AE của bộ kit. Lưu ý nhỏ dung dịch vào giữa màng để màng được thấm đều, nếu không sẽ không thu được sản phẩm.
3. Một số thông tin cơ bản về kit QIAamp DNA Blood Mini Kit và DNA Mini Kit
Đặc điểm | Thông số |
| Ứng Dụng | PCR, long-range PCR, Southern blotting |
| Thể tích DNA thu hồi | 50–200 µl |
| Định dạng | Spin column |
| Loại mẫu chính | Whole blood, body fluids |
| Quy trình | Thủ công, có thể được tự động trên máy QIACUBE |
| Loại sản phẩm thu được | Genomic DNA, mitochondrial DNA, viral DNA. Vi khuẩn, nấm ( Chỉ với QIAamp DNA Mini Kit) |
| Lượng mẫu đầu vào | 1–200 µl |
| Công nghệ | Silica technology |
| thời gian tách | 20–40 minutes |
| Lượng sản phẩm | 4–12 µg |
Thông tin chi tiết về kit QIAamp DNA Blood Mini Kit và QIAamp DNA Mini Kit tham khảo ở bài viết http://chienbio.blogspot.com/2015/07/lua-chon-kit-tach-chiet-dnarna-hang.html
Để có thêm chi tiết vui lòng liên hệ với nhà phân phối của Qiagen tại Việt Nam
Tài liệu tham khảo:
1. https://www.qiagen.com/vn/shop/sample-technologies/dna-sample-technologies/genomic-dna/qiaamp-dna-blood-mini-kit/#technicalspecification
2. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook 3nd Edittion, Qiagen GmbH
Nguồn: Blog Chienbio